Aside Dirençli Bakteriler

Aside Dirençli Bakteriler (Acid-Resistant Bacteria)

Aside dirençli bakteriler (Acid-Resistant Bacteria, ARB), güçlü asitlerle yıkandıklarında bile boyalarını koruyabilen bakterilerdir. Bu bakteriler, hücre duvarlarında yüksek miktarda mikolik asit ve lipitler bulundururlar. Bu yapı, onların asit-fast (aside dirençli) özellik kazanmalarına neden olur. En yaygın aside dirençli bakteriler, Mycobacterium türleridir, ancak Nocardia gibi diğer bakteriler de bu kategoriye girebilir.

Aside dirençli bakterilerin keşfi ve boyanma yöntemleri, tıp ve mikrobiyoloji alanında önemli bir dönüm noktasıdır. 19. yüzyılın sonlarında, Robert Koch tüberkülozun etkeni olan Mycobacterium tuberculosis'i keşfetti. Bu keşif, aside dirençli bakterilerin tanınması ve teşhis yöntemlerinin geliştirilmesi için bir başlangıç noktası oldu.

Paul Ehrlich, 1882 yılında, bu bakterilerin asit-fast (aside dirençli) özelliklerini keşfetti. Ehrlich'in çalışmaları, bakterilerin boyanma özelliklerini ve asit-fast karakteristiklerini anlamamıza yardımcı oldu. Hans Christian Gram tarafından geliştirilen Gram boyama yöntemine benzer şekilde, aside dirençli boyama teknikleri de mikroorganizmaların farklı boyanma özelliklerine dayanır.

Aside dirençli bakterilerin gram boyamada yeterince görünür hale gelmemesinin nedeni nedir?

Aside dirençli bakteriler; özellikle Mycobacterium türleri, Gram boyama sırasında mikroskopta yeterince görünür hale gelmezler. Bunun başlıca nedeni, hücre duvarlarının benzersiz kimyasal yapısıdır. Mycobacterium bakterilerinin hücre duvarları, yüksek miktarda mikolik asit ve lipitler içerir. Bu yapı, aşağıdaki nedenlerle Gram boyamanın etkinliğini azaltır:

1. Hücre Duvarının Yapısı:
   • Aside dirençli bakterilerin hücre duvarı, kalın ve kompleks bir yapıdadır. Bu yapı, peptidoglikan tabakasının ötesinde, mikolik asit ve çeşitli lipitler içerir. Gram boyasında kullanılan kristal violet ve iyot kompleksi, bu kalın ve hidrofobik duvar nedeniyle bakterilere nüfuz etmekte zorlanır.
2. Boyaların Tutunma Gücü:
   • Gram boyama işlemi sırasında, kristal violet boyası hücre duvarına tutunur ve Lugol solüsyonu ile sabitlenir. Ancak; aside dirençli bakterilerin hücre duvarı, bu boyaları güçlü bir şekilde tutmaz. Alkol veya aseton ile yapılan yıkama işlemi sırasında, boyalar hücre duvarından kolayca çıkar. Bu nedenle, bu bakteriler Gram boyasında renksiz veya çok soluk görünebilir.
3. Asit-Fast Özelliği:
   • Aside dirençli bakteriler; asit-fast özellikleri sayesinde, çok güçlü asitlerle yıkandıklarında bile boyalarını korurlar. Gram boyama sırasında kullanılan alkol, bu bakterilerin hücre duvarına etkili olamaz ve bu nedenle, bakteriler yeterince boyanmaz.

Bu nedenlerden ötürü, aside dirençli bakterilerin tespiti için özel boyama tekniklerine ihtiyaç duyulmuştur. Ziehl-Neelsen boyama ve Auramin-Rodamine boyama gibi yöntemler, bu bakterilerin hücre duvarlarına özel boyaların nüfuz etmesini sağlar ve onları görünür hale getirir.

Aside dirençli bakteriler genellikle aşağıdaki gruplara ayrılır:

1. Mycobacterium Türleri:
   • Mycobacterium tuberculosis: Tüberküloza neden olan bakteri.
   • Mycobacterium leprae: Lepra (cüzzam) hastalığına neden olan bakteri.
   • Atypik Mycobacteria: Mycobacterium avium-intracellulare kompleksi gibi, genellikle bağışıklık sistemi zayıf olan bireylerde enfeksiyona neden olan türler.
2. Nocardia Türleri:
   • Nocardia asteroides: Nocardiosis adı verilen ve genellikle akciğerleri etkileyen enfeksiyona neden olur.
3. Diğer Bakteriler:
   • Rhodococcus: Çeşitli enfeksiyonlara neden olabilen bir grup bakteridir.

Aside Dirençli Bakteriler İçin Özel Boyama Setleri Ve Teknikleri

GBL Gül Biyoloji Laboratuvarı olarak; aside dirençli bakterilerin teşhisinde kullanılan başlıca özel boyama setleri şunlardır:

1. Ziehl-Neelsen Aside Dirençliler Boyama Seti:

		ÜRÜN ADI			: Ziehl-Neelsen Aside Dirençliler Boyama Seti
		MARKASI			: GBL® Rosa-Stain
		ÜRÜN REF NO			: 5017
		Stok Kodu Ambalaj Şekli Birim Ambalaj Hacmi 445017050050 50 ml, HDPE Damlalıklı Beyaz Şişe 50 ml 445017050250 250 ml, PP Damlalıklı Beyaz Şişe 250 ml 445017020500 500 ml, HDPE Beyaz Şişe 28 mm 500 ml
Set Komponentleri
A	Karbol Fuksin Çözeltisi ZN		1 Adet
B	Asit Alkol		2 Adet
C	Metilen Mavisi Çözeltisi		1 Adet

Kullanım Amacı:

Özellikle Mycobacterium tuberculosis ve Mycobacterium leprae gibi patojenlerin tespiti için kullanılır.

Çalışma Prensibi:

Mycobacterium, nocardia ve corynebacterium’ların duvarlarında taykoik asit yoktur. Duvarın %35'ine yakın kısmı lipitlerden ve özellikle mikolik asitten oluşmaktadır. Duvarın bu özelliğinin, asit ve alkole karşı bakteri duvarının dayanıklılığını arttırdığı varsayımı üzerinde durulmaktadır. Bunlar, aldıkları boyayı kolayca bırakmazlar; yani Fuksin boyasını tutarlar. Basillerin duvarı asitli alkole dayanıklı olduğundan, boya basilde kalır.

Boyama aşamaları:

1.Preparatı “A-Karbol Fuksin Çözeltisi ZN” ile örtün.

2.Alttan 5 dakikadan az olmak şartı ile ısıtın.

3.Distile suyla 15 saniye yıkayın.

4.Preparatı “B-Asit Alkol Çözeltisi” ile örtün. 15 saniye sonra lamı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.

5.Distile suyla 15 saniye yıkayın.

6.Preparatı “C-Metilen Mavisi Çözeltisi” ile örtün. 30 saniye sonra lamı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.

7.Distile suyla 15 saniye yıkayın.

8.Havada, tercihen ısıtıcılı tabla üzerinde kurutun. Mikroskopta inceleyin.

Kalite Kontrol sonuçları:
Aside dirençli mikroorganizmalar	Kırmızı
Diğer Mikroorganizmalar	Mavi
Arka Alanlar	Mavi

2. Truant Auramin Rodamin Aside Dirençliler Floresan Boyama seti:

		ÜRÜN ADI			:Truant Auramin Rodamin Aside Dirençliler Floresan Boyama seti
		MARKASI			: GBL® Rosa-Stain
		ÜRÜN REF NO			: 5118
		Stok Kodu Ambalaj Şekli Birim Ambalaj Hacmi 445118050250 250 ml, PP Damlalıklı Beyaz Şişe 250 ml 445118050500 500 ml, HDPE Beyaz Şişe 28 mm 500 ml
Set Komponentleri
A	Auramin Rodamin Çözeltisi		1 Adet
B	Asidik Ağartma Çözeltisi		2 Adet
C	Potasyum Permanganat Çözeltisi		1 Adet

Kullanım Amacı:

Özellikle Mycobacterium türlerinin hızlı ve hassas tespiti için kullanılır.

Çalışma Prensibi:

Floresan mikroskobu kullanılarak aside dirençli basilleri görselleştirmek için kullanılan bir boyama tekniğidir. Aside dirençli organizmalar kırmızımsı sarı bir floresans renk sergiler. Auramin-rodamin boyası, aside dirençli organizmalar (örn. Mycobacterium tuberculosis veya Nocardia ) için Ziehl-Neelsen boyası kadar spesifik olmasa da, daha hızlı sonuçlar verir, bu nedenle sıklıkla bir tarama aracı olarak kullanılır .

Boyama aşamaları:

• “A- Auramin Rodamin Çözeltisi” ile örtün. 15 dakika sonra silkeleyerek uzaklaştırın.
• Distile suyla yıkayın.
• “B- Asidik Ağartma Çözeltisi” ile örtün. 1 dakika sonra silkeleyerek uzaklaştırın. Bu süre zarfında birçok kez ayıracı değiştirebilirsiniz.
• Distile suyla yıkayın.
• “C- Potasyum Permanganat Çözeltisi” ile örtün. 3 dakika sonra preparatı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.
• Akar distile suyla yıkayın.
• Floresan mikroskopta inceleyin.

Kalite Kontrol sonuçları:
Aside dirençli mikroorganizmalar	Sarıdan kırmızımsıya kadar değişen floresan
Arka alanlar	Siyah

3. Kinyoun Aside Dirençliler Boyama Seti:

		ÜRÜN ADI		: Kinyoun Aside Dirençliler Boyama Seti
		MARKASI		: GBL® Rosa-Stain
		ÜRÜN REF NO		: 5109
		Stok Kodu Ambalaj Şekli Birim Ambalaj Hacmi 445109050250 250 ml, PP Damlalıklı Beyaz Şişe 250 ml 445109020500 500 ml, HDPE Beyaz Şişe 28 mm 500 ml
Set Komponentleri
A	Karbol Fuksin Çözeltisi ZN		1 Adet
B	Asit Alkol		2 Adet
C	Metilen Mavisi Çözeltisi		1 Adet

Kullanım Amacı:

Ziehl-Neelsen boyamanın soğuk versiyonu olup, ısı kullanmadan yapılan bir tekniktir.

Çalışma Prensibi:

Mycobacterium, nocardia ve corynebacterium’ların duvarlarında taykoik asit yoktur. Duvarın %35'ine yakın kısmı lipitlerden ve özellikle mikolik asitten oluşmaktadır. Duvarın bu özelliğinin, asit ve alkole karşı bakteri duvarının dayanıklılığını arttırdığı varsayımı üzerinde durulmaktadır. Bunlar, aldıkları boyayı kolayca bırakmazlar; yani Fuksin boyasını tutarlar. Basillerin duvarı asitli alkole dayanıklı olduğundan, boya basilde kalır.

Boyama aşamaları:

1. Yaymayı “A-Karbol Fuksin Çözeltisi FK” ile örtün. 2 dakika sonra silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.
2. Distile suyla yıkayın.
3. Yaymayı “B-Asit Alkol” çözeltisi” ile yıkayın. Sıvı lamdan renksiz akıncaya kadar renksizleştirilir.
4. Distile suyla yıkayın. Fazla suyu preparattan akıtın.
5. Yaymayı “C-Metilen Mavisi Çözeltisi” ile örtün. 30 saniye sonra lamı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.
6. Distile su ile iyice yıkayın. Fazla suyu preparattan akıtın.
7. Yaymayı havada, tercihen ısıtıcılı tabla üzerinde kurutun. Kurutma kâğıdı ile kurutmayın.
8. Yayma 100’lük immersiyonlu objektifle incelenir.

Kalite Kontrol sonuçları:
Aside dirençli mikroorganizmalar	Kırmızı
Diğer mikroorganizmalar, arka alan	Mavi

4. ARB Boyama Seti FK

		ÜRÜN ADI		: ARB Boyama Seti FK
		MARKASI		: GBL® Rosa-Stain
		ÜRÜN REF NO		: 5104
		Stok Kodu Ambalaj Şekli Birim Ambalaj Hacmi 445109050250 250 ml, PP Damlalıklı Beyaz Şişe 250 ml
Set Komponentleri
A	Karbol Fuksin Çözeltisi FK		1 Adet
B	Alkolik Çözeltisi, %1 Sülfürik asitli		2 Adet
C	Metilen Mavisi Çözeltisi		1 Adet

Kullanım Amacı:

Aside dirençli bakterilerin boyanarak tespit edilmesi amacıyla kullanılır.

Çalışma Prensibi:

Mycobacterium, nocardia, cryptosporidium ve corynebacterium’ların duvarlarında taykoik asit yoktur. Duvarın %35'ine yakın kısmı lipitlerden ve özellikle mikolik asitten oluşmaktadır. Duvarın bu özelliğinin, asit ve alkole karşı bakteri duvarının dayanıklılığını arttırdığı varsayımı üzerinde durulmaktadır. Bunlar, aldıkları boyayı kolayca bırakmazlar; yani Fuksin boyasını tutarlar. Basillerin duvarı asitli alkole dayanıklı olduğundan, boya basilde kalır. %1 Sülfürik Asitli Çözeltisi; aside dirençli bakteriler üzerinde kalmış olan boyayı korurken, diğer hücrelerdeki fazla boyayı çıkararak saflık sağlar. Sülfürik asit, özellikle aside dirençli bakterilerin, örneğin Mycobacterium tuberculosis'un boyanmış kalmasını sağlar.

Boyama aşamaları:

1.Preparatı “A-Karbol Fuksin Çözeltisi FK” ile örtün.

2. Alttan 5 dakikadan az olmak şartı ile ısıtın.

3. Distile suyla 15 saniye yıkayın.

4. Preparatı “B- Alkolik Çözelti, %1 Sülfürik Asitli” ile örtün. 15 saniye sonra lamı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.

5. Distile suyla 15 saniye yıkayın.

6. Preparatı “C-Metilen Mavisi Çözeltisi” ile örtün. 30 saniye sonra lamı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.

7. Distile suyla 15 saniye yıkayın.

8. Havada, tercihen ısıtıcılı tabla üzerinde kurutun. Mikroskopta inceleyin.

Kalite Kontrol sonuçları:
Aside dirençli mikroorganizmalar	Kırmızı
Diğer mikroorganizmalar, arka plan	Mavi

5. Modifiye ARB Boyama Seti

		ÜRÜN ADI		: Modifiye ARB Boyama Seti
		MARKASI		: GBL® Rosa-Stain
		ÜRÜN REF NO		: 5010
		Stok Kodu Ambalaj Şekli Birim Ambalaj Hacmi 445010020500 500 ml, HDPE Beyaz Şişe 28 mm 500 ml
Set Komponentleri
A	Karbol Fuksin Çözeltisi ZN		1 Adet
B	Asit Alkol		2 Adet
C	Metilen Mavisi Çözeltisi		1 Adet

Kullanım Amacı:

Aside dirençli bakterilerin boyanarak tespit edilmesi amacıyla kullanılır.

Çalışma Prensibi:

Modifiye ARB yöntemlerinde, klasik Ziehl-Neelsen yöntemindeki gibi geniş çaplı ısı uygulaması gerekmeyebilir. Genellikle daha hafif bir ısı uygulaması veya hiç ısı uygulanmayabilir. Modifiye ARB setlerinde boyaların formülasyonları veya konsantrasyonları değiştirilebilir. Bu, boya çözeltisinin daha iyi penetrasyon ve sabitleme özelliklerine sahip olmasını sağlayabilir.

Boyama aşamaları:

1. Preparatı “A-Karbol Fuksin Çözeltisi ZN” ile örtün.

2. Alttan 2-5 dakika ısıtın.

3. Distile suyla 15 saniye yıkayın.

4. Preparatı “B- Asit Alkol Çözeltisi” ile örtün. 15 saniye sonra lamı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.

5. Distile suyla 15 saniye yıkayın.

6. Preparatı “C-Metilen Mavisi Çözeltisi” ile örtün. 30 saniye sonra lamı silkeleyerek ayıracı uzaklaştırın.

7. Distile suyla 15 saniye yıkayın.

8. Havada, tercihen ısıtıcılı tabla üzerinde kurutun. Mikroskopta inceleyin.

Kalite Kontrol sonuçları:
Aside dirençli mikroorganizmalar	Kırmızı
Diğer mikroorganizmalar, arka plan	Mavi

6. Aside Dirençliler Boyama Seti; Brilliant Yeşilli

		ÜRÜN ADI		: Aside Dirençliler Boyama Seti; Brilliant Yeşilli
		MARKASI		: GBL® Rosa-Stain
		ÜRÜN REF NO		: 5020
		Stok Kodu Ambalaj Şekli Birim Ambalaj Hacmi 445020050250 250 ml, PP Damlalıklı Beyaz Şişe 250 ml
Set Komponentleri
A	Karbol Fuksin Çözeltisi ZN		1 Adet
B	Asit Alkol		2 Adet
C	Brilliant Yeşili Boyası		1 Adet

Kullanım Amacı:

Aside dirençli bakterilerin boyanarak tespit edilmesi amacıyla kullanılır.

Çalışma Prensibi:

Örnek, lam üzerine yayılır ve fikse edilir. Karbol fuksin çözeltisi, aside dirençli bakterilerin hücre duvarlarına bağlanmak için kullanılır. Boyama işleminden sonra, preparatlar asidik alkol çözeltisi ile işlenir. Asidik alkol, karbol fuksin boyasını, aside dirençli bakteriler dışındaki hücrelerden temizler. Bu adım, sadece aside dirençli bakterilerin boyalı kalmasını sağlar, diğer hücreler veya yapıların temizlenmesini sağlar. Dekolorizasyon işleminin ardından, preparatlara brilliant yeşili boyası uygulanır. Bu boya, arka planı ve aside dirençli bakterilerin dışındaki diğer hücreleri yeşil renkte boyar.

Boyama aşamaları:

1.Yayma Karbol Fuksin Boyası ile bir bek veya elektrikli boyama rafı kullanarak 5 dakika buhar çıkışı görülene kadar lam yavaşça alttan ısıtılarak boyanır. (Düşük ısıyla veya aralıklı ısı kullanarak 3-5 dakika süreyle buharlaşması devam ettirilir.)

2.Lam soğumaya bırakılır.

3.Lam 5-10 saniye kadar sudan geçirilir.

4.Yayma Asitli Alkol ile 5-30 saniye kadar örtülür.

5.Hassas bir şekilde distile suyla çok kısa yıkanır.

6.Yayma Brillant Yeşili Boyası ile 1-2 dakika kadar boyanır.

7.Hassas bir şekilde distile suyla yıkanır.

8.Havada kurutulur.

9.Yayma 100 ‘lük immersiyonlu objektifle incelenir.

Kalite Kontrol sonuçları:
Aside dirençli mikroorganizmalar	Kırmızı
Diğerleri ve arka alan elemanları	Yeşil

Aside dirençli bakterilerin teşhisinde kullanılan özel boyama setlerinin dışında, müşterilerimizin istekleri dahilinde set komponentleri ayrı olarak ve istenilen hacimlerde temin edilebilmektedir.

Klinik Önemi ve Kullanım Alanları

Aside dirençli boyalar, özellikle klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında hastalıkların teşhisinde kritik bir rol oynar. Başlıca kullanım alanları şunlardır:

1. Tüberküloz Teşhisi:
   • Mycobacterium tuberculosis'in tespiti, hastalığın doğru bir şekilde teşhis edilmesi ve tedaviye başlanması için hayati önem taşır. Asit dirençli boyama, bu bakterinin varlığını hızla ve güvenilir bir şekilde belirler.
2. Lepra Teşhisi:
   • Mycobacterium leprae, cüzzam hastalığına neden olur. Asit dirençli boyama teknikleri, bu patojenin tespitinde kullanılır.
3. Diğer Mikobakteriyel Enfeksiyonlar:
   • Özellikle bağışıklık sistemi zayıf olan hastalarda, non-tüberküloz mikobakterilerin tespiti için kullanılır.
4. Nocardiosis ve Diğer Enfeksiyonlar:
   • Nocardia gibi diğer asit dirençli bakterilerin tespiti de bu yöntemlerle mümkündür.

Yazar: Ebubekir ERTAŞ / Biyolog

Birim: Mikroskopi Ürün Grubu Sorumlusu

Tarih : 13.07.2024